Dalam proses melakukan studi genetik, kita sering menemukan sampel RNA yang tidak mencukupi, misalnya untuk mempelajari tumor anatomi kecil di mulut, bahkan sampel sel tunggal, dan sampel mutasi gen spesifik yang ditranskripsi pada tingkat yang sangat rendah dalam sel manusia.Tentu saja, untuk tes COVID-19, jika swab tidak berada di tempat yang tepat atau tidak cukup waktu selama pengambilan sampel, ukuran sampel akan sangat sedikit, itulah sebabnya Komisi Kesehatan dan Keluarga Berencana keluar dua hari lalu dan lulus tes, dan jika pengambil sampel asam nukleat tidak mengambil enam sampel, Anda dapat melaporkannya.
Sensitivitas reagen penting karena kita punya masalah ini atau itu, jadi apa yang bisa kita lakukan untuk meningkatkan sensitivitas RT-PCR?
Sebelum kita membahas solusi yang mungkin, mari kita sebutkan dua komplikasi besar dengan situasi yang baru saja kita sebutkan.
Pertama-tama, kami khawatir tentang hilangnya RNA ketika kami hanya memiliki sedikit populasi sel dalam sampel kami.Jika metode pemisahan dan pembersihan tradisional digunakan, seperti metode kolom atau metode pengendapan asam nukleat, kemungkinan besar beberapa sampel akan hilang.Salah satu solusinya adalah menambahkan molekul pembawa, seperti tRNA, tetapi meskipun demikian, tidak ada jaminan bahwa percobaan pemulihan kami baik-baik saja.
Jadi apa cara yang lebih baik?Pilihan yang baik untuk sel kultur atau sampel mikroanatomi adalah dengan menggunakan lisis langsung.
Idenya adalah untuk membelah sel selama 5 menit, melepaskan RNA ke dalam larutan, kemudian menghentikan reaksi selama 2 menit, kemudian menambahkan lisat langsung ke reaksi transkripsi terbalik sehingga tidak ada RNA yang hilang, dan akhirnya menempatkan cDNA yang dihasilkan secara langsung. ke dalam reaksi real-time.
Tetapi bagaimana jika, karena titik awal yang terbatas atau jumlah ekspresi gen target yang sedikit, kita dapat mendaur ulang semua RNA dan tetap tidak menyediakan templat yang cukup untuk mendapatkan sinyal real-time yang baik?
Dalam hal ini, langkah pra-amplifikasi bisa sangat berguna.
Berikut ini adalah skema untuk meningkatkan sensitivitas setelah transkripsi terbalik.Sebelum memulai, kita perlu bertanya ke hilir target mana yang kita minati, untuk merancang primer khusus untuk target pra-amplifikasi ini.
Ini dapat dicapai dengan membuat primer campuran dengan hingga 100 pasang primer dan siklus reaksi 10 hingga 14 kali.Oleh karena itu, Master Mix yang dirancang khusus untuk persyaratan ini diperlukan untuk melakukan pra-amplifikasi cDNA yang diperoleh.
Alasan untuk menetapkan jumlah siklus antara 10 dan 14 adalah karena jumlah siklus yang terbatas ini memastikan keacakan antara berbagai target, yang sangat penting bagi peneliti yang membutuhkan informasi molekuler kuantitatif.
Setelah pra-amplifikasi, kami dapat memperoleh cDNA dalam jumlah besar, sehingga sensitivitas deteksi di bagian belakang sangat meningkat, dan kami bahkan dapat mengencerkan sampel dan melakukan beberapa reaksi PCR waktu nyata untuk menghilangkan kemungkinan kesalahan acak.
Waktu posting: Apr-11-2023